【最新成果】丁苯酞減輕腦出血後炎症反應和水腫

發表於：2020年07月03日 發表人：亚博最新版集團

2020年6月來自中南大學湘雅第二醫院神經內科胡治平教授研究團隊的最新成果《L-3-n-butylphthalide attenuates inflammation response and brain edema in rat intracerebral hemorrhage model 》在《Aging》雜誌發表（IF=4.831）。

本研究旨在探討NBP對大鼠ICH模型的治療作用，並探討其潛在的分子機製。研究結果證明：NBP抑製TNF-α和MMP-9的表達，減少炎症反應，改善血腦屏障通透性，減輕ICH誘導的損傷區域細胞毒性和血管性水腫。本研究結果為腦出血的治療和NBP的臨床應用提供了有力證據。


01  研究背景

腦出血是中風最嚴重的亞型，在中低收入國家中發病率高，死亡率高。盡管人們對ICH（腦出血）的認識不斷發展，但死亡率並未隨時間推移降低。目前，ICH的30天死亡率仍然高達35–50％，其中約50％的死亡率發生在發病前兩天內。ICH後的腦損傷大致可分為原發性和繼發性腦損傷。原發性腦損傷主要是由血腫破壞和壓迫腦組織引起的。繼發性腦損傷主要是由於炎症反應，加劇血腫附近的腦水腫。ICH後腦水腫可導致不良結果，例如嚴重的神經功能缺損，腦疝甚至死亡。關於ICH治療的臨床前報道很多，其中大多數集中在原發性損傷的治療上，例如顱內壓降低，血壓控製和康複，並且在臨床上應用。但不幸的是，沒有一種臨床治療方法能夠減輕因炎症反應引起的繼發性腦損傷來提高ICH後的生存率。NBP已有研究表明可能通過多種機製對缺血性中風有治療作用，包括減少缺血性中風的炎症反應，減輕小膠質細胞活化，降低細胞因子水平如腫瘤壞死因子-α（TNF-α），減少血腦屏障（BBB）損傷和腦水腫，並促進髓鞘再生。本研究主要探討NBP對大鼠ICH模型的治療作用。


02 研究方法


本實驗將45隻成年雄性Sprague-Dawley大鼠（10周齡，280-320g）隨機分為三組：
（1）假手術組（n=15），無ICH模型；
（2）ICH模型大鼠采用生理鹽水處理的對照組（n=15）；
（3）ICH模型采用NBP處理的治療組（n=15）。
通過評估手術後48小時的神經功能，血腫周圍腦水含量，血腦屏障通透性以及腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)和基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)的表達來評價NBP的治療效果。在ICH後4h和48h分別進行磁共振成像T2加權圖像測量腦損傷區域體積。



03 研究結果


1、NBP改善腦出血後的神經功能缺損情況

腦出血會使神經功能受損，本研究采用改良Garcia(mGarcia)神經評分檢測NBP對腦出血後神經功能缺損的治療作用。該評分神經損傷越嚴重，mGarcia評分越低。術後48h，假手術組mGarcia評分正常。vehicle組和NBP組大鼠腦出血術後出現左側偏癱現象。雖然vehicle組/NBP治療組的mGarcia評分明顯低於假手術組(P<0.05)，意味這兩組的大鼠在ICH術後均出現了明顯的神經功能缺損，但NBP治療組的大鼠獲得的mGarcia評分明顯高於對照組(P<0.05；圖1A)。這些結果表明，NBP治療可以有效改善ICH損傷後的神經功能缺損。

2、NBP減輕腦出血後的腦水腫形成

腦水腫是腦出血後繼發性腦損傷的表現之一。本研究通過觀察生理鹽水或NBP治療後腦水腫的程度來探討NBP對腦出血後腦水腫的影響。vehicle組腦含水量明顯高於假手術組（P<0.05）。此外，NBP組的腦含水量明顯低於vehicle組（P<0.05；圖1B）。HE染色也觀察到類似的結果。在vehicle組中觀察到明顯的組織水腫，但NBP治療顯著改善了腦水腫（圖1C）。結果表明，NBP可減輕腦出血後水腫。

3、NBP降低腦出血後血腦屏障通透性

采用改良的EB染色法觀察血腦屏障的血管通透性。vehicle組EB滲出量明顯高於假手術組（P<0.05）。此外，NBP組的EB滲出明顯低於vehicle組（P<0.05；圖1D）。結果表明，NBP能顯著降低大鼠ICH模型中EB的外滲量，降低BBB的通透性。

圖1.NBP的治療作用

（A） NBP改善了腦出血後的神經功能；

（B）NBP減輕了腦出血後水腫；

（C）腦組織HE染色（標度：200μm）；

（D）NBP降低了腦出血後BBB的通透性。

在腦出血模型建立後48小時記錄數據，以平均值±標準差（每組n=6）表示。*，P<0.05。NBP：丁苯酞；BBB：血腦屏障；ICH：腦出血。


4、NBP降低腦出血後血腫擴大

采用磁共振成像（magnetic resonance imaging,MRI）觀察腦出血模型大鼠，以直觀地顯示NBP對腦出血模型大鼠血腫擴大的影響。vehicle組和NBP治療組的SD大鼠在ICH模型建立後均有清晰可辨的血腫形成，如圖2典型的T2加權圖像所示。vehicle組和NBP治療組腦血腫在T2加權成像的信號強度在4h後呈低強度，在48h轉為高強度（圖2A）。在ICH造模後4h對大鼠頭部進行MRI掃描，NBP治療組的血腫體積與對照組大致相同，無統計學意義上的差異（P>0.05）。而術後48小時再次對大鼠頭部行MRI掃描，發現在術後4h至48h期間，對照組的血腫體積明顯增大，而NBP治療組的血腫體積無明顯變化。即NBP治療組的血腫再擴大體積明顯小於對照組（15.22±3.31mm3 vs 2.91±0.40mm3，P＜0.05；圖 2B），說明NBP能有效抑製ICH後血腫再擴大體積

5、NBP抑製促炎因子TNF-α和MMP-9的表達

以往研究表明，炎症可能是ICH後繼發性腦損傷和腦水腫形成的關鍵機製之一。為了探討NBP對腦出血大鼠模型的抗炎作用，我們首先檢測了血腫周圍腦組織中促炎因子TNF-α的表達水平。Western-blotting結果顯示腦出血損傷導致腫瘤壞死因子-α表達增加。同時，NBP治療能顯著降低TNF-α的表達。我們還檢測了血腫周圍皮質組織中MMP-9的表達。與假手術組相比，vehicle組TNF-α與MMP-9表達均上調。與vehicle相比，NBP組MMP-9的表達水平下降（圖2C）。用免疫組化染色觀察TNF-α和MMP-9表達與Western-blotting有相似結果（圖2D）。提示NBP具有抗炎作用，可預防腦出血後繼發性損傷。

圖2.NBP對腦出血後損傷麵積變化的影響

（A）vehicle組和NBP組代表性的T2-WI圖像；

（B）定量不同時間點（ICH後4小時和48小時）的血腫體積；

（C）血腫周圍腦組織中TNF-α和MMP-9的表達；

（D）免疫組化染色法測定血腫周圍腦組織中TNF-α和MMP-9的表達（標度：200μm）。

Δ表示擴大的損傷麵積體積，用4小時時測量的體積減去48小時時測量的體積。數據以平均值±標準差表示（每組n=3）。n.s，無顯著性差異；*，P<0.05。ICH：腦出血；NBP：丁苯酞；MMP-9：基質金屬蛋白酶-9；TNF-α：腫瘤壞死因子α。


6、NBP抑製氧化應激和DNA損傷

氧化應激與炎症密切相關，因此本文還研究了NBP對超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、活性氧（ROS）水平的影響。在vehicle組中，SOD（圖3A）降低，但MDA（圖3B）和ROS（圖3C）顯著增加。但NBP處理顯著逆轉了這種趨勢，抑製了氧化應激。同時測定NBP處理後DNA損傷標誌物γ-H2AX。我們發現NBP顯著抑製了γ-H2AX的水平，表明NBP可以抑製DNA損傷（圖3D）。

圖3.NBP抑製氧化應激和DNA損傷

（A） 血清SOD水平；血清MDA水平；腦組織ROS水平（300μm）；血腫周圍腦組織γ-H2AX表達。數據表示為平均值±標準差（n=3，每組）。*，P<0.05。ROS：活性氧；SOD：超氧化物歧化酶；MDA：丙二醛。        


圖4.NBP能減輕腦出血時的炎症和腦水腫

NBP治療能顯著抑製炎症反應，減輕腦出血引起的水腫，保護BBB不受破壞。

BBB：血腦屏障；CNS：中樞神經係統；MMP-9：基質金屬蛋白酶-9；NBP：丁苯酞；ROS：活性氧；TNF-α：腫瘤壞死因子α。




綜上所述，本研究結果表明NBP能抑製TNF-α和MMP-9的表達，從而減輕炎症反應，降低BBB通透性、減輕ICH誘導的損傷區及細胞毒性和血管性水腫。這一發現為腦出血的治療和NBP的臨床應用提供了依據。同時，丁苯酞在腦出血方麵正在開展國家十三五項目“丁苯酞對急性腦出血的幹預及保護研究”，標誌著丁苯酞在臨床方麵對腦出血領域的探索。

04 背景資料

恩必普（化學名：丁苯酞）是亚博最新版新藥研發成果的代表之一，是我國第三個具有自主知識產權的國家一類新藥，也是腦卒中治療領域的全球領先藥物，上市以來為1000多萬名卒中患者治愈或減輕了疾病困擾。